10.03.2023
Гипоксия нормальных и раковых клеток
Согласно упрощенному определению, гипоксия – это состояние, возникающее в результате доставки кислорода, недостаточной физиологическими потребностями. Ее можно разделить на физиологическую гипоксию, которая быстро инвертируется повышенным кровотоком и протеомными изменениями, индуцированными гипоксия-индуцибельными факторами, и патологическую гипоксию, которая ведет к нарушению биологической функции. Физиологическая гипоксия возникает в период эмбрионального развития, в период интенсивных физических нагрузок и в условиях высокогорья. Патологическая гипоксия может ассоциироваться с легочными заболеваниями, анемией, некорректным формирование метгемоглобина, отравлением или редуцированным тканевым кровоснабжением, которое также наблюдается в солидных опухолях [1].
Гипоксия может определяться набором статусов оксигенации. На одном конце шкалы находится аноксия, которая является статусом полного отсутствия O2 в тканях. Строгое определение труднее установить, когда рассматривается другой конец шкалы. В противовес гипоксии часто упоминают нормоксию. Термин нормоксия соответствует атмосферному давлению кислорода, которое обычно обеспечивается для культур in vitro. Условия оксигенации культуры, которые обычно составляют примерно 21% рО2, не являются репрезентативными по сравнению с физиологическим состоянием клеток. Ткани имеют различные балансы газовой смеси в зависимости от их васкуляризации и физиологических потребностей. Оксигенация колеблется от 19,7%, наблюдаемой во вдыхаемом воздухе в трахее, до 1% на поверхностных участках кожи. Поэтому невозможно определить базисные гипоксии по конкретным границам процентного содержания кислорода. В заключение, понимание гипоксии вызвало необходимость уточнения дополнительного термина — физоксия, который соответствует физиологическому состоянию давления кислорода, наблюдаемому в нормальных тканях. В условиях реализации гетерогенной3 оксигенации гипоксию можно определить как уровень ниже физоксии [2].
Уровень оксигенации в раковых клетках, как правило, ниже, чем в их тканях [2]. Höckel и Vaupel предложили определять гипоксию в опухолях по уровню падения рО2, вызывающего снижение потребления О2 и продукции АТФ. Гипоксию также можно отследить, индуцируя специфические изменения протеома, которые позволяют раковым клеткам адаптироваться к лишению ресурсов. Эти изменения включают альтерации в активности ферментов гликолиза и элементы вовлеченные в ангиогенез, инвазивность и резистентность [1]. Другим способом определения гипоксии в канцере является определение критической точки оксигенации, которая составляет 8-10 мм рт.ст. Однако следует понимать, что опухоли имеют неравномерное распределение гипоксической и аноксической областей и уровней оксигенации, как и в нормальных тканях, которые могут варьировать в зависимости от происхождения раковых клеток [2].
Гипоксию можно разделить на острую, которая является результатом перфузия-ограниченной доставки кислорода, и хроническую гипоксию, которая развивается вследствие диффузия-ограниченной оксигенации [3]. Хроническая гипоксия в опухолях может вызываться дисрегуляторной сосудистой сетью, ухудшением геометрии диффузии и нарушением кровообращения, а может намеренно перераспределяться в пользу раковых клеток [1].
В нормальных клетках возникновение гипоксии ведет к редукции протеинового синтеза, уменьшению пролиферации и, в конечном итоге, к гибели апоптозом или некрозом. В раковых клетках гипоксия способствует клеточной пролиферации и опухолевому прогрессированию, когда формируется более агрессивный фенотип [3,4]. Недостаточная оксигенация опосредованно повреждает ДНК, вызывая мутации, разрывы, окислительные повреждения оснований и гиперрепликацию. Повреждения ДНК возникают в результате гипоксия-опосредованных нарушений электронно-транспортной цепи, которые индуцируют продукцию ROS (активные формы кислорода). Гипоксия также промотирует полиплоидию, которая является результатом репликации генома без деления клеток. Изменения, индуцированные в генах, вызывают адаптацию и метастазирование раковых клеток [4]. Гипоксия в раковых клетках благоприятствует селекции более гипоксия-резистентных клеток, которые имеют тенденцию быть более злокачественными. Дефицит кислорода также промотирует резистентность к лучевой и противоопухолевой терапии; это также может снижать эффективность фотодинамической терапии [1]. Гипоксия нарушает доставку и активность многих противоопухолевых препаратов; она также снижает эффективность рН-зависимых соединений и алкилирующих агентов [4].
Гипоксия-индуцибельные факторы: характеристики и функции
Критическим элементом гипоксического ответа и адаптации является активность транскрипционного фактора, называемого гипоксия-индуцибельный фактор. Он состоит из двух субъединиц: кислород-сенситивной α-субъединицы (имеющей три изоформы: 1α, 2α и 3α) и β-субъединицы, также называемой ARNT (Aryl Hydrocarbon Receptor Nuclear Translocator). HIF принадлежат к bHLH-PAS семейству протеинов, и обе субъединицы содержат основные домены спираль-петля-спираль-PAS, ответственные за взаимодействие друг с другом и связывание с ДНК [5]. В физиоксических условиях период полураспада α-субъединиц составляет примерно пять минут, после чего они подвергаются протеасомной деградации. Процесс утилизации α-субъединицы преимущественно регулируется протеинами, принадлежащими к суперсемейству 2-оксоглутарат-зависимых диоксигеназ — пролилгидроксилаз (PHD).
Пролил-гидроксилирование происходит по специфическим сайтам в кислород-зависимом домене: в HIF-1α по пролинам Р402 и Р564, в HIF-2α по пролинам Р405 и Р531 и в HIF-3α по пролину Р492 [6]. Гидроксилирование пролиловых остатков повышает сродство субъединицы к von Hippel-Lindau опухоль-супрессорному протеину. После гидроксилирования VHLp наделяется активностью Е3 убиквитинлигазы, распознает модифицированный HIF-1α и полиубиквитинирует его, направляя субъединицу на протеасомную деградацию [4]. Сайты гидроксилирования могут модифицироваться независимо, но обычно гидроксилируются одновременно для избыточности [7]. Вторым механизмом регуляции HIF-α при физоксии является гидроксилирование аспарагинильного остатка, катализируемое фактором, ингибирующим HIF (FIH).
Модификация аспарагина результирует в блокирование связывания коактиваторов гипоксия-индуцибельного фактора [5]. Аспарагинил-гидроксилирование происходит в С-концевом домене трансактивации (C-TAD) на N803 в HIF-1α и на N851 в HIF-2α. HIF-3α не содержит C-TAD домен; следовательно, активность FIH на него не влияет [6]. Активность изоформы HIF-3α, вероятно, является еще одним механизмом регуляции изоформ HIF-1α и HIF-2α. Считается, что некоторые варианты сплайсинга 3α изоформы, например, ингибиторный PAS домен (IPAS), негативно регулируют активность других изоформ гипоксия-индуцибельного фактора [8]. HIF-1α и HIF-2α изоформы включают сходные характеристики регуляции, хотя они активны в различных типах гипоксии. В молекулярных характеристиках эти изоформы имеют примерно 48% идентичности аминокислотной последовательности [8]. HIF-2α, также называемый эндотелиальным PAS доменным протеином (EPAS1), отличается от субъединиц HIF-1α прежде всего N-концевым доменом трансактивации (N-TAD), а C-TAD домены имеют 67% совпадений [9]. ]. При недостаточной оксигенации пролилгидроксилазы теряют активность вследствие потери О2 субстрата, что результирует в стабилизацию α-субъединицы [5]. Стабилизированная α-субъединица формирует комплекс с конститутивно-экспрессируемой β-субъединицей и образует активный гетеродимер. Затем комплекс гипоксия-индуцибельного фактора может связываться с гипоксия-отвечающими элементами (HRE) в ДНК с помощью задействованных коактиваторов CBP/p300. Активный гетеродимер связывается с промотерами или энхансерами таргетных генов [10]. В недавних исследованиях обнаружено 2450 потенциальных транскрипционных таргетных генов гипоксия-индуцибельного фактора [11], но, как правило, число таргетных генов, которые регулируются и могут наблюдаться, колеблется от 100 до 150 [4,10]. HIF-1α и HIF-2α разделяют значительную часть таргетных генов, но некоторые уникальны только для одного из них [4].
HIF-1α стабилизируется в случае острой гипоксии, но его уровень начинает снижаться при длительной гипоксии. В хронической гипоксии повышается уровень HIF-2α [2]. Регуляция этого переключения с изоформы HIF-1α на изоформу HIF-2α включает несколько механизмов. Во-первых, изоформа HIF-2α кажется более резистентной к гидроксилированию, поддерживаемому PHD и FIH, и к регуляции другими факторами; следовательно, он демонстрирует гораздо более высокую стабильность, чем HIF-1α [12,13]. Транскрипционная активность HIF-2α способствует активации гипоксия-ассоциированного фактора (HAF), активность которого связана с убиквитинированием субъединицы HIF-1α, что приводит к ее деградации [14]. Другими возможными механизмами переключения гипоксия-индуцибельных факторов являются несенситивная РНК экспрессия, активируемая HIF-2α, модификации хроматина, активность REST (response element 1-silencing transcription factor) и регуляции miRNA [8].
В физиологических условиях гипоксия-индуцибельный фактор задействован в эмбриональном развитии, развитии системы кровообращения, хондрогенезе, адипогенезе, остеогенезе, кроветворении, развитии элементов иммунной системы. Он играет протективную роль при ишемической болезни сердца, заболеваниях периферических артерий, заживлении ран, отторжении трансплантата органов и колите. Однако фактор HIF также вносит вклад в патогенез наследственного эритроцитоза, травматического шока, заболеваний легких, апноэ во сне и рака [5].
Активация гипоксия-индуцибельного фактора в канцере
Состояние гипоксии является характерной чертой солидных опухолей. Существующие кровеносные сосуды поддерживают рост раковых клеток до тех пор, пока масса опухоли не превысит 2 мм3. После этого опухолевый рост зависит от поставки кислорода, обеспечиваемой новыми кровеносными сосудами, развившимися в процессе ангиогенеза. Однако васкуляризация часто ведет к формированию дезорганизованных или высоко проницаемых сосудов, что приводит к созданию гипоксической или даже аноксической зон [15]. Тем не менее корреляция между возникновением гипоксических областей и гиперрегуляцией гипоксия-индуцибельного фактора непостоянна, что предполагает другие лежащие в основе механизмы его активации. Кроме того гемобластозы также демонстрируют гиперрегуляцию гипоксия-индуцибельного фактора [7]. Значительный процент (88%) нормальных тканей человека не содержит HIF-1α вследствие его быстрой деградации. Тем не менее, его можно обнаружить более чем в половине случаев рака [16]. Уровень HIF-1α отрицательно коррелирует со степенью клеточного дифференцирования, доказывая, что более недифференцированные и менее зрелые и специализированные клетки, такие как раковые клетки, как правило, содержат больше HIF-1α [18].
Активация гипоксия-индуцибельного фактора может быть вызвана различными путями, не ограничиваясь гипоксией. Одним из самых простых примеров является мутация в гене, кодирующем von Hippel-Lindau супрессорный протеин. Альтерация в VHL гене является самым ранним событием в развитии почечно-клеточного рака, наиболее типичного типа рака почки. Мутация von Hippel-Lindau супрессора результирует в постоянную экспрессию α-субъединицы HIF независимо от уровня оксигенации [19]. Присутствие активных форм кислорода, типичное в канцере, также может активировать гипоксия-индуцибельный фактор, создавая псевдогипоксическое состояние. Повышенный уровень ROS может потенциально повреждать клетку, но сублетальный груз стимулирует транскрипционную активность HIF и снижает активность пролилгидроксилаз [15].
Следовательно, пониженная продукция ROS ассоциирована с редуцированным уровнем α-субъединицы [20]. Другой чертой раковых клеток, которая может вести к активации HIF, является дисрегуляция трансдукторных путей. Гиперактивация PI3K/PTEN/Akt, RAS/RAF/MAPK и NFκB сигнальных путей через цитокины, хемокины, G-протеин-сцепленные рецепторы и toll-подобные рецепторы также могут модулировать HIF-сигналинг [4]. Активация транскрипционных факторов также может быть результатом повышенного уровня присутствующих в клетках онкометаболитов — канонических метаболитов, которые аккумулируясь выше определенного уровня обладают проонкогенными свойствами. Сукцинат, фумарат, пируват и лактат могут аллостерически ингибировать PHD, что приводит к стабилизации α-субъединицы [21]. В тройном негативном раке молочной железы повышение уровня HIF-1α обусловлено избыточной секрецией глутамата [4]. Другое изменение активности пролилгидроксилаз связано с низкой доступностью 2-оксоглутарата или α-кетоглутарата, которые являются субстратами PHD, или дефицитом железа, чье связывание с каталитическим центром необходимо для ферментативной активности гидроксилаз [7,21]. Повышенный гликолиз в канцере, ассоциированный с эффектом Warburg, также способствует активации гипоксия-индуцибельного фактора, а активность фактора способствует глюкозному метаболизму. Феномен результирует в повышенный уровень киназы пируватдегидрогеназы (PDK), которая ингибирует пролилгидроксилазы, создавая петлю обратной связи, в которой повышенная активность HIF вызывает повышение уровня транскрипционного фактора [19]. Повышенный активность М2 изоформы пируваткиназы, часто ассоциированная с эффектом Warburg, также может способствовать активации HIF. Кроме того, повышенный лактат, один из наиболее характерных признаков аэробного гликолиза, также стабилизирует α-субъединицу путем ингибирования PHD [7]. Менее экстенсивно обсуждаемые факторы, активность которых способствует стабилизации гипоксия-индуцибельного фактора, включают снижение активности р53, факторы, модулирующие активность VHLp (c-Myc, WSB1), mTOR-опосредованная стимуляция стабилизации гамма-лучами, и изменения кальциевого гомеостаза [21].
В раке молочной железы, как и при других видах рака, гиперэкспрессия HIF не ограничивается самой гипоксией. Рак молочной железы представляет собой несколько уникальных путей неканонической индукции активности гипоксия-индуцибельных факторов. Например, повышенная активность пути PI3K/Akt/mTOR, наблюдаемая в раке молочной железы, может вести к повышенному уровню HIF-1α. Хотя повышенная активность пути сигнальной трансдукции характерна не только для этого типа рака, в BC гиперэкспрессия HER2 или ER рецепторов может способствовать повышению уровня HIF-α через путь PI3K/Akt/mTOR [23]. Более того, повышенный уровень ER рецептора способствует повышению уровня HIF-1α за счет элементов ответа на эстроген, расположенных в промоторе HIF1α [15]. ER-α прямо индуцирует транскрипцию HIF-1α, но ER-β оказывает противоположное действие на активность HIF, деградируя HIF-1β, тем самым ухудшая димеризацию субъединиц [24]. ER-β2, вариант сплайсинга ER-β рецептора, участвует в регуляции PHD3, что впоследствии приводит к стабилизации HIF-α. Несмотря на взаимосвязь между рецепторами эстрогенов и гипоксия-индуцибельным фактором, основанная на иммуногистохимии клинических образцов рака молочной железы, более высокая частота HIF-1α наблюдалась в ER-α-отрицательных образцах по сравнению с ER-α-положительными [26]. О несоответствии между активностью HIF и уровнем транскрипта уже сообщалось в клетках тройного негативного рака молочной железы, что может свидетельствовать о роли механизмов посттранскрипционной регуляции [15]. Корреляции между экспрессией HIF2α и статусом ER не наблюдалось [27]; аналогично HER2 статус в зависимости от гиперрегуляции HIF1α не сообщался [28]. Однако исследование на клинических образцах рака молочной железы показало, что HIF-2α был значительно выше в образцах с гиперэкспрессируемыми рецепторами HER2. Эти данные свидетельствуют о том, что HIF-2α, но не HIF-1α, может регулироваться HER2 [22].
Другая регуляция активности HIF включает ZMYND8 (zinc finger MYND-type containing an 8). Его роль представляет собой механизм петли положительной обратной связи, в котором ZMYND8 физически взаимодействует с α-субъединицей HIF и повышает ее активность. Повышенная транскрипционная активность HIF, как HIF-1α, так и HIF-2α, связана с гиперрегуляцией ZMYND8, замыкая петлю. Гиперрегуляция ZMYND8 и его роль в прогрессировании и метастазировании рака молочной железы ассоциированы с активностью гипоксия-индуцибельных факторов [29]. Внеклеточный АТФ также может управлять активацией HIF в нормоксии благодаря пути Akt [30]. Активность этого трансдукторного пути, индуцируемая присутствием внеклеточной АТФ, результирует в повышенный уровень активности PGK1, который образует петлю прямой связи с изоформой HIF-1α, чья активность приводит к гиперрегуляции PGK1 [31].
Продолжение следует
